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Jun 26, 2023

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Scientific Reports volume 13, numero articolo: 2934 (2023) Cita questo articolo 943 Accessi 3 Dettagli metriche alternative L'effettiva interazione tra le specie segnalatrici nei processi cellulari è spesso

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 2934 (2023) Citare questo articolo

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Dettagli sulle metriche

L'effettiva interazione tra le specie segnalatrici nei processi cellulari è spesso più importante dei loro livelli di espressione. Il trasferimento di energia per risonanza di Förster (FRET) è uno strumento popolare per studiare le interazioni molecolari, poiché è altamente sensibile alla prossimità nell'intervallo 2-10 nm. Il FRET quantitativo (3 cubi) con correzione dello spillover spettrale è un approccio conveniente e versatile, che può essere applicato nella citometria a flusso e in varie modalità di microscopia a fluorescenza, ma può essere ostacolato da diversi livelli di autofluorescenza. Qui, abbiamo implementato la correzione dell'autofluorescenza pixel per pixel nelle misurazioni FRET al microscopio, sfruttando standard di calibrazione privi di cellule privi di autofluorescenza che consentono la corretta determinazione di tutti i fattori di spillover spettrali. Presentiamo anche un plugin ImageJ/Fiji per l'analisi interattiva di singole immagini e per la creazione automatica di mappe quantitative di efficienza FRET da grandi set di immagini. Per la validazione, abbiamo utilizzato modelli FRET basati su perline e cellule che coprivano una gamma di rapporti segnale/autofluorescenza ed efficienza FRET e abbiamo confrontato l'approccio con la correzione media convenzionale di autofluorescenza/fondo. La correzione dell'autofluorescenza pixel per pixel si è rivelata superiore in termini di accuratezza dei risultati, in particolare per i campioni con autofluorescenza spazialmente variabile e bassi rapporti fluorescenza/autofluorescenza, quest'ultimo spesso il caso dei livelli di espressione fisiologica.

Il trasferimento di energia per risonanza di Förster (FRET) è un trasferimento di energia non collisionale e non radiativo tra un colorante donatore fluorescente e un colorante accettore spettralmente adeguato, che, per scopi pratici, viene spesso scelto come fluorescente1. A partire dalla fine degli anni ’60, FRET è gradualmente diventato uno strumento popolare per determinare la prossimità tra macromolecole. L'efficienza del trasferimento di energia (E) è una funzione della sesta potenza inversa della distanza tra i coloranti donatore e accettore, che cambia rapidamente nell'intervallo 2-10 nm. Questo intervallo di sensibilità serve come base per stabilire e confrontare le interazioni a livello molecolare anche in strumenti ottici che altrimenti sarebbero limitati a un potere risolvente inferiore dovuto alla diffrazione2. Anche con il rapido miglioramento delle tecniche di superrisoluzione che spingono il limite di risoluzione sempre più in basso, è rimasto molto spazio per le tecniche FRET3. Esiste un'ampia varietà di approcci per misurare il FRET in microscopia4, dalle misurazioni di singole molecole5,6 agli approcci d'insieme, molti dei quali non richiedono strumentazione costosa e/o non sono distruttivi per il campione7,8,9. Questi comprendono metodi raziometrici che sono meglio utilizzati nel campo in continua espansione dei biosensori basati su proteine ​​fluorescenti con stechiometria donatore/accettore nota10, nonché modalità di misurazione quantitativa che producono efficienza FRET calibrata indipendente dalla stechiometria donatore/accettore11. Di questi, l'imaging a fluorescenza (FLIM) rappresenta un metodo intrinsecamente quantitativo ma richiede strumentazione avanzata12,13, mentre il FRET con correzione dello spillover spettrale (o a tre cubi) è un approccio conveniente e versatile, che può essere applicato in citometria a flusso e convenzionale microscopia a fluorescenza. A differenza della popolare tecnica di fotosbiancamento dell'accettore14,15, può essere utilizzata anche insieme all'analisi time-lapse e alle immagini 3D11,16.

La limitazione principale in ogni metodo per le misurazioni FRET è il rapporto segnale/rumore (SNR). SNR è il valore atteso del segnale diviso per la sua SD. Qui, il rumore di tutte le intensità di fluorescenza misurate utilizzate in ulteriori calcoli si propaga nell'efficienza FRET. Supponendo una distribuzione Poissoniana dei fotoni rilevati per pixel con valore atteso λ, se il rumore sistematico è trascurabile, l'SNR è √λ, quindi si prevede che intensità inferiori aumentino l'incertezza del FRET E determinato in misura maggiore. I campioni con SNR basso possono essere resi più suscettibili all'analisi FRET migliorando l'efficienza quantica e la fotostabilità dei coloranti fluorescenti, utilizzando un rilevamento più efficiente17, ottimizzando le coppie di coloranti FRET18,19 e migliorando approcci matematici e statistici20,21,22, 23. L'uso del metodo con correzione dello spillover spettrale generalmente consente di trarre conclusioni sulle interazioni molecolari esistenti quando si osserva un'efficienza FRET di ~ 5% o superiore.