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Jul 02, 2023

Quantificazione dell'assorbimento di nanoparticelle fluorescenti nelle cellule di mammifero utilizzando un lettore di piastre

Scientific Reports volume 12, numero articolo: 20146 (2022) Cita questo articolo 1988 Accessi 1 Citazioni 5 Dettagli metriche alternative In linea con la rapida espansione delle applicazioni delle nanoparticelle,

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 20146 (2022) Citare questo articolo

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Dettagli sulle metriche

In linea con la rapida espansione delle applicazioni delle nanoparticelle, sono necessari vari strumenti per studiare il modo in cui le nanoparticelle interagiscono con le entità biologiche. Sono stati sviluppati numerosi test per misurare l'assorbimento cellulare delle nanoparticelle, ma finora la maggior parte dei metodi sono laboriosi e spesso non quantitativi. Qui abbiamo sviluppato un metodo di misurazione quantitativa robusto e facilmente accessibile del livello di assorbimento cellulare di nanoparticelle marcate in modo fluorescente utilizzando un lettore di piastre. Nel disegno sperimentale sono stati identificati e affrontati potenziali problemi che potrebbero portare a variazioni di misurazione. Ad esempio, la variazione dell'intensità della fluorescenza dei campioni dovuta alle differenze nel numero di cellule è stata normalizzata in base alla densità ottica, che è un valore fisico corrispondente al numero di cellule. Il numero di lavaggi e la temperatura di manipolazione del campione sono stati ottimizzati per ridurre al minimo l'interferenza delle nanoparticelle residue e il possibile efflusso di nanoparticelle dalle cellule, rispettivamente. Il test sviluppato è stato dimostrato con la linea cellulare linfocitaria Jurkat per misurare l'assorbimento cellulare di perline di polistirene da 50 nm marcate in modo fluorescente e la sua applicabilità è stata ulteriormente confermata con la linea cellulare di carcinoma polmonare A549 e un'altra linea cellulare linfocitaria RPMI8226.

I recenti sviluppi nel campo delle nanotecnologie offrono diverse opportunità nei settori sanitario1, alimentare2 e cosmetico3, ma sollevano anche preoccupazioni sulla potenziale tossicità4,5. Per studiare le prestazioni e la sicurezza dei nanomateriali, dobbiamo comprendere il loro ciclo di vita costituito da incontro e riconoscimento – interiorizzazione – traffico – distribuzione – ed efflusso attraverso vari esperimenti biologici. L’assorbimento delle nanoparticelle è un processo ampio che comprende l’incontro, il riconoscimento e l’internalizzazione6. A seconda dell'utilizzo, il livello di assorbimento deve essere modulato per aumentare la consegna o per evitare un assorbimento indiscriminato. Ad esempio, nelle applicazioni mediche, mentre si dovrebbe evitare l’eliminazione delle nanoparticelle da parte dei macrofagi7, si dovrebbe migliorare l’efficienza del rilascio delle nanoparticelle a un organo bersaglio. Sono stati condotti un'ampia gamma di studi sull'assorbimento di nanomateriali con cellule di mammiferi7,8,9, procarioti10 e piante11, solo per citarne alcuni. L'assorbimento cellulare è governato da molti parametri diversi6,12 come le proprietà fisiche delle nanoparticelle tra cui dimensione, forma e carica superficiale, nonché le condizioni sperimentali tra cui i tipi cellulari13 e il ciclo cellulare14. Anche la variabilità da cellula a cellula esiste nell'assorbimento delle nanoparticelle, come rivelato in un sofisticato esperimento di Åberg et al.15.

Sono state impiegate numerose analisi per quantificare l'assorbimento di nanomateriali16. Le più comunemente utilizzate sono le tecniche basate sulla microscopia elettronica17,18,19 o ottica20,21. Le misurazioni delle proprietà ottiche come la diffusione e la fluorescenza sono state impiegate anche per la quantificazione con citometri a flusso8,10,14 e lettori di micropiastre19,22,23,24,25,26,27. Le tecniche basate sul plasma accoppiato induttivamente (ICP), come la spettrometria di massa ICP28 e la spettroscopia di emissione atomica ICP26,29 sono un altro strumento utile per quantificare le nanoparticelle nelle cellule, ma sono distruttive e applicabili solo alle particelle metalliche. Sono state adottate anche altre tecniche, come la microscopia a raggi X a trasmissione, la tomografia a cellule intere e l'imaging iperspettrale, ma le loro applicazioni sono limitate. Sebbene esistano numerose tecniche per la quantificazione delle nanoparticelle nelle cellule e nei tessuti, sono ancora richieste tecniche più affidabili, riproducibili e intercomparabili, anch'esse comunemente utilizzate30.

I lettori di piastre si trovano in ampie applicazioni di misurazione che vanno da piccoli come ioni metallici31 a grandi quanto sferoidi cellulari. Le loro capacità multimodali e ad alto rendimento hanno facilitato lo sviluppo di diverse analisi basate sulle cellule, tra cui proliferazione, morte, attività enzimatica e altri test fenotipici. La combinazione con i recenti progressi nella gestione dei liquidi e nei sistemi di controllo ambientale ha consentito analisi dinamiche più sofisticate. Soprattutto, i lettori di lastre sono apparecchiature facili da usare che non richiedono competenze elevate e possono essere utilizzate in vari modi.